MF2514_3: Aplicación de técnicas complementarias en cultivos celulares

Aplicación de técnicas complementarias en cultivos celulares

MF2514_3.

Módulo de formación MF2514_3: Aplicación de técnicas complementarias en cultivos celulares.

Aplicar técnicas complementarias en cultivos celulares

60 horas.

C1: Aplicar técnicas de contaje celular en cultivos celulares, determinando la viabilidad, apoptosis y senescencia celular.

• CE1.1 Definir viabilidad, apoptosis y senescencia, asociándolos a técnicas complementarias en cultivos celulares.
• CE1.2 Enumerar colorantes y moléculas fluorescentes utilizados en cultivos celulares, considerando sus ventajas e inconvenientes.
• CE1.3 Describir técnicas de contaje de células, manuales y automáticos, en relación con cultivos celulares, precisando materiales y colorantes.
• CE1.4 Explicar procedimientos para estudio de la senescencia en cultivos celulares, indicando materiales, colorantes, substratos colorimétricos y fluorescentes.
• CE1.5 Describir métodos de determinación de la citotoxicidad/proliferación, considerando ensayos MTT y similares (XTT, resazurina).
• CE1.6 Explicar la técnica de TUNEL, asociándola a la identificación de apoptosis en un cultivo celular.
• CE1.7 En un supuesto práctico de contaje, determinación de senescencia y de apoptosis celular:
  • – Realizar la tinción de senescencia en cultivos celulares mediante la tinción de galactosidasa.
  • – Aplicar la técnica de TUNEL, identificando apoptosis en un cultivo celular.
  • – Contar células, empleando la cámara de Neubauer y azul tripano como colorante vital.

C2: Aplicar técnicas de extracción de ácidos nucleicos en cultivos celulares, utilizando sistemas automáticos y manuales.

• CE2.1 Identificar técnicas de extracción de ácidos nucleicos en cultivos celulares, indicando sus aplicaciones.
• CE2.2 Describir técnicas de identificación de la apoptosis en un cultivo celular, realizando electroforesis de ADN en gel de agarosa.
• CE2.3 Explicar procedimientos de purificación y cuantificación de ácidos nucleicos, detallando la purificación de ARN mensajero a partir de ARN total.
• CE2.4 En un supuesto práctico de extracción de ácidos nucleicos en cultivos celulares, utilizando sistemas automáticos y manuales:
  • – Extraer ADN y ARN, aplicando distintas técnicas.
  • – Purificar ácidos nucleicos obtenidos, empleando columnas.
  • – Almacenar ADN y/o ARN en viales específicos, según su registro y, en el caso de ARN, utilizando el reactivo requerido.

C3: Analizar técnicas de citometría de flujo, reconociendo sus posibles aplicaciones.

• CE3.1 Definir los procesos de citometría de flujo y separación celular (Fluorescent Activated Cell Sorter) (FACS), enumerando sus aplicaciones.
• CE3.2 Describir componentes de un citómetro, indicando su funcionamiento.
• CE3.3 Explicar la técnica de tinción con anexina V para la determinación de la apoptosis, utilizando citometría de flujo.
• CE3.4 Describir la técnica de tinción con ioduro de propidio para la determinación del ciclo celular, mediante citometría de flujo.
• CE3.5 En un supuesto práctico de aplicaciones de citometría de flujo:
  • – Estudiar la apoptosis celular, aplicando la técnica de tinción con anexina V.
  • – Determinar calcio intracelular, marcadores intra y extracelulares y genes reporteros, utilizando el citómetro de flujo.
  • – Analizar por citometría de flujo el ciclo celular, aplicando la técnica de ioduro de propidio.

C4: Aplicar técnicas de control de contaminación de los cultivos celulares, reconociendo los tipos de contaminantes.

• CE4.1 Identificar fuentes de contaminación de los cultivos celulares, diferenciando contaminación por microorganismos y contaminación por otras células en cultivo.
• CE4.2 Reconocer los organismos contaminantes de los cultivos celulares, considerando sus características morfológicas.
• CE4.3 Describir técnicas de prevención y tratamiento de las contaminaciones por microorganismos de los cultivos celulares, indicando antibióticos y antifúngicos empleados.
• CE4.4 Describir contaminaciones por otras células en cultivo similares, precisando procedimientos de trabajo para su prevención.
• CE4.5 Explicar procedimientos para detección de micoplasmas en cultivos celulares, empleando técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la plimerasa), entre otras.
• CE4.6 Describir técnicas de perfil genético para la identificación de líneas celulares, garantizando la autenticidad de los cultivos.
• CE4.7 En un supuesto práctico de control de contaminación de los cultivos celulares:
  • – Detectar micoplasmas, aplicando técnicas de PCR.
  • – Aplicar antibióticos y antifúngicos, previniendo la contaminación y tratamiento de los cultivos.
  • – Aplicar técnicas de perfil genético, identificando las líneas celulares.

C5: Analizar procedimientos de modificación genética, aplicando técnicas de transfección y transducción viral.

• CE5.1 Definir transfección y transducción viral, estableciendo diferencias.
• CE5.2 Describir técnicas de transfección, diferenciando sus tipos.
• CE5.3 Explicar técnicas de transducción viral, indicando las características biológicas de los diferentes virus empleados.
• CE5.4 Describir eficiencia y viabilidad, en relación con la transfección viral, indicando métodos para su cálculo.
• CE5.5 Describir multiplicidad de infección, eficiencia y viabilidad, asociándolos a la transducción viral.
• CE5.6 Establecer medidas de bioseguridad en el manejo de virus, considerando sus características biológicas.
• CE5.7 Reconocer técnicas de generación de partículas virales, utilizando cultivos celulares.
• CE5.8 En un supuesto práctico de modificación genética:
  • – Realizar ensayos de transfección celular, utilizando ADN.
  • – Indicar la eficiencia y la viabilidad de la transfección, realizando los cálculos requeridos.
  • – Comprobar la transfección celular, verificando la expresión del gen transfectado.

C6: Aplicar técnicas de diferenciación y reprogramación genética de un cultivo celular, controlando su viabilidad y asepsia.

• CE6.1 Definir los términos linaje celular y célula madre, indicando los diferentes niveles de potencialidad celular.
• CE6.2 Explicar la diferenciación, transdiferenciación, y reprogramación genética, detallando sus características.
• CE6.3 Describir estructuras supracelulares empleadas en diferenciación, precisando cuerpos embrioides (EBs), neuroesferas, cardioesferas, agregados celulares.
• CE6.4 Describir las células reprogramadas (iPSCs), indicando sus características.
• CE6.5 En un supuesto práctico de diferenciación y reprogramación celular:
  • – Diferenciar células madre, considerando varios tipos celulares.
  • – Realizar ensayos de caracterización de las células diferenciadas, seleccionando las técnicas previamente.
  • – Reprogramar células, empleando vectores no virales.

Capacidades cuya adquisición debe ser completada en un entorno real de trabajo:

C1 respecto a CE1.7; C2 respecto a CE2.4; C3 respecto a CE3.5; C4 respecto a CE4.7; C5 respecto a CE5.8 y C6 respecto a CE6.5.

Otras capacidades:

• Proponerse objetivos retadores que supongan un nivel de rendimiento y eficacia superior al alcanzado previamente.
• Emplear tiempo y esfuerzo en ampliar conocimientos e información complementaria.
• Mantener una actitud asertiva, empática y conciliadora con los demás demostrando cordialidad y amabilidad en el trato.
• Favorecer el desarrollo profesional y personal en el equipo de trabajo.
• Demostrar creatividad en el desarrollo del trabajo que realiza.
• Demostrar resistencia al estrés, estabilidad de ánimo y control de impulsos.
• Adoptar códigos de conducta tendentes a transmitir el contenido del principio de igualdad.

1. Técnicas de control de contaminación de cultivos celulares

• Fuentes de contaminación en el laboratorio de cultivo celular: baños de agua, trampas de vacío, bandejas de incubadores, mala asepsia del operario, entre otras.
• Tipos de organismos contaminantes: micoplasmas, bacterias, hongos y levaduras.
• Empleo de antibióticos (Penicilina-Estreptomicina) y antifúngicos (anfotericina-B) como prevención y tratamiento de los cultivos.
• Agentes antimicrobianos empleados en el laboratorio de cultivos: superficies de cobre, sulfato de cobre, iones de plata, aditivos para el agua de baños y depósitos de agua de los incubadores.
• El micoplasma como contaminante silencioso: mecanismos de control.
• Técnicas de detección de micoplasmas: visualización por agentes fluorescentes, PCR, ensayos enzimáticos luminiscentes.
• Tratamiento y eliminación de los micoplasmas de los cultivos.
• Contaminación del cultivo por otras células en cultivo similares: técnicas de prevención.
• Identificación de líneas celulares mediante perfil genético para garantizar la autenticidad del cultivo.

2. Técnicas complementarias aplicadas a cultivos celulares

• Técnicas de contaje y viabilidad celular.
• Métodos de contaje celular: manual (cámara de Neubauer) y automático (contadores ópticos y por principio Coulter).
• Viabilidad, apoptosis, senescencia e inmortalidad.
• Colorantes empleados en contaje y viabilidad: azul tripano.
• Moléculas fluorescentes empleadas en contaje y viabilidad: calceína AM, diacetato de fluoresceína, ioduro de propidio, homodímero de etidio, naranja de acridina, azul alamar.
• Técnicas de determinación de apoptosis: TUNEL.
• Moléculas fluorescentes empleadas: ioduro de propidio, anexina V-FITC y otros fluoróforos (PE, APC, entre otros), substratos fluorescentes de caspasas.
• Técnicas empleadas en senescencia: ensayo b-galactosidasa.
• Substratos colorimétricos (X-Gal) y fluorescentes (FDG).
• Determinación de la proliferación/citotoxicidad mediante ensayos MTT y similares (XTT, resazurina).
• Técnicas de extracción de ácidos nucleicos.
• Ácidos nucleicos.
• Diferencias entre el ADN y el ARN.
• Purificación de ácidos nucleicos mediante métodos manuales y automáticos.
• Empleo de columnas de purificación.
• Extracción de ADN y ARN total mediante el método de Chomczynski (Trizol y productos similares basados en GTC).
• Extracción de ADN y ARN citoplásmico mediante la técnica de lisis citoplasmática y proteinasa K.
• Importancia de purificar el ARN mensajero.
• Aplicaciones de los ácidos nucleicos extraídos: Southern Blots, Northern Blots, construcción de librerías, PCR, RT-PCR, qPCR, clonaje diferencial de genes, IP, ChIP, cribado de arrays, y otras.
• Citometría de flujo y separación celular (FACS).
• Tipos de citómetro y componentes esenciales de un citómetro.
• Aplicaciones de la citometría de flujo: análisis del ciclo celular, apoptosis, medidas de calcio intracelular, expresión de marcadores intra y extracelulares, expresión de genes reporteros.
• Técnicas de transfección y transducción viral.

• Plásmidos y genes reporteros.

• Transfección estable y transitoria.
• Técnicas físicas (electroporación, biobalística).
• Técnicas químicas (DEAE-dextrano, fosfato de calcio, lípidos catiónicos).
• Transducción viral: retrovirus y lentivirus, adenovirus, virus Sendai.
• Selección de clones o colonias (plaqueo espaciado o dilución límite) en las transfecciones estables, para obtener líneas celulares.
• Técnicas de diferenciación y reprogramación celular.
• Diferenciación y transdiferenciación.
• Reprogramación genética.
• Potencialidad celular.
• Niveles de potencialidad (totipotencia, pluripotencia, multipotencia y unipotencia).
• Desarrollo embrionario.
• Hojas embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo.
• Tipos de células atendiendo a sus diferentes linajes celulares.
• Características de las células reprogramadas (iPSCs).
• Técnicas de reprogramación genética: genes de reprogramación, sustitución de genes por moléculas activadoras, vectores virales y no virales, mezcla de plásmidos y plásmidos policistrónicos.
• Diferenciación de células madre hacia distintos tipos celulares: empleo de suplementos específicos, biomoléculas, productos químicos y otros.
• Diferenciación mediante la generación previa de supraestructuras celulares: cuerpos embrioides (EBs), neuroesferas, cardioesferas, agregados celulares, entre otros.

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